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Cellsorter亞納升精密壓電吸管用于單細胞分離和液滴打印

更新時間:2022-01-10 點擊量:3648

 

盡管使用手持式移液管處理微升級液體是一項常規任務,但由于表面張力、粘附力和蒸發效應等技術難題,移液納升級體積具有挑戰性。Cellsorter開發了一種全自動壓電微移液管,精度<1納升,將基于成像的單細胞分離效率提高到90%以上。這一改進在分離稀有或珍貴細胞時至關重要,尤其是在醫療應用中。緊湊的壓電微移液管可以集成到各種(生物)化學工作流程中。它消除了塑料管、閥門、注射器和壓力罐對于樣品的高質量相襯照明,例如細胞或微小液滴.Cellsorter構建了與微移液管同心排列的LED環。同樣的裝置可以在顯微鏡上使用熒光或透明照明,方便地用于試劑的單細胞打印和納升級液滴打印。Cellsorter設想這項新技術不久將成為醫學診斷中單細胞操作的標準工具,例如循環腫瘤細胞分離。

在實驗室中,毫升(ml)或微升(μl)刻度的液體處理是一項常規任務,例如,使用手持移液管。然而,0.1μl以下的處理量是一個挑戰。如果液滴的尺寸小于毛細管長度,則微小液滴的動力學主要取決于重力作用下的表面張力。對于標準溫度和壓力下的水和空氣界面,毛細管長度約為2 mm。小液滴與移液管固體表面之間的粘附力在該長度范圍內也至關重要。小水滴的快速蒸發是另一個困難。在流體系統中,密封將流體保持在管道或通道內。在大多數情況下,密封件由軟彈性材料制成:各種橡膠或PTFE。由于流體部分被彈性材料包圍,因此在微觀尺度上控制其體積很麻煩。然而,當試劑的體積受到限制時,例如在單細胞測量中,納升(nl)或皮升(pl)級液體處理是一個主要優勢。

微流控芯片處理微小體積流體的簡單解決方案是使用具有微米大小通道的微流控芯片來傳導水溶液。將微流體集成到復雜芯片中是非常有前景的,其主要目標是實現芯片上實驗室系統?;谝旱蔚奈⒘黧w(Guo等人2012;K?ster等人2008;Agresti等人2010;Brouzes等人2009;Leung等人2012)處理懸浮在石油環境中的亞納米級水滴。然而,目前可用的微流體存在許多技術缺陷(Leung等人,2012年)。這些芯片對介質的固體污染非常敏感。需要使用含有適當表面活性劑的特殊且昂貴的油來維持穩定的乳液。在大多數情況下,實現流量的適當穩定性是一項挑戰,更不用說在試驗前和試驗后的瞬態效應了, 液滴內捕獲的單個細胞可以單獨進行DNA條形碼編碼、匯集和隨后測序(Lee等人,2016年)。然而,在這個過程中,單個細胞的表型信息丟失了。因此,DNA/RNA序列不能與腫瘤或發育組織中特定細胞的作用相關。

壓電液滴系統可以通過微移液管注入nl或pl大小的液滴(www/scienion/com/; www/cytena/com)。注射器中的壓電致動器產生壓力波,從毛細管中注入液滴。注射器不能像手持式移液管一樣在同一周期內抽取和沉積小體積的液體。此解決方案僅在空氣中有效。壓電注射器機器人可用于打印,但不能用于流體的pl–nl 級采樣。

使用玻璃微移液管的微注射器和FluidFM微注射/精確到飛秒級是細胞生物學中一項眾/所/周/知的技術(Takagi et al.2007)。也可以使用微流控原子力顯微鏡(FluidFM)進行微注射(Meister等人,2009年)。但是,微型噴射器不能以高精度拉動和噴射相同的流體。由于長,宏觀彈性管和密封,當他們拔出液體后開始注射時,這些設備工作時有很大的滯后.

SODA機器人——機器人(Zhu等人,2013年)使用由注射泵控制的1μl Hamilton注射器,并連接到帶有1厘米泰貢管的玻璃微量移液管,從而將拉注過程的誤差降至更低。然而,這種zui/先/進的設置很難常規應用。即使在這個專門的系統中,拉和沉積循環也只能實現納升精度。SODA機器人的熱體積波動也很明顯。SODA機器人的另一個缺點是漢密爾頓注射器和毛細管之間固有的1厘米短管,導致難以操作的設置。該裝置的速度受注射泵的速度限制。SODA機器人的最終精度也受到漢密爾頓注射器和注射泵的限制。

根據顯微圖像使用微量移液管拾取細胞進行單細胞分離是一種成熟的方法(Kurimoto等人,2006年;Hosokawa等人,2009年)。為了提高通量和效率,在過去幾年中出現了應用電動顯微鏡和微操作器的半自動化技術(Schneider等人,2008年;Yoshimoto等人,2013年;K?rnyei等人,2013年)。商用微移液管法的液體處理精度受到將微移液管連接至真空罐的長(~1 m)塑料管的限制(K?rnyei等人,2013年;Salánki等人,2014a;Ungai Salánki等人,2016年)。管的彈性導致納升級流體流動的滯后。微移液管中的流量不僅受壓力罐中的真空或超壓的影響,還受管的彈性膨脹的影響。盡管這一限制可以在研究實驗室處理,以實現單細胞RNA測序(Kozlov等人2017;Ngara等人2018)、循環腫瘤細胞(CTC)分離(Winter等人2018)的結果,蛋白質工程(Piatkevich et al.2018)或單細胞粘附實驗(Salánki et al.2014b;Sándor et al.2016;Ungai Salánki et al.2019),妨礙了它們在醫學診斷中的常規應用。

盡管如此,閥控射流系統的簡單性和靈活性仍有幾個優點,包括其應用恒定、穩定和高真空的能力,以及由此產生的高流體動力。如果需要,可將微移液管收集的液體體積設置為高(幾微升)。這在分離強粘附細胞或測量細胞粘附力時非常有用。當前開發的背景是閥控細胞分選儀(www/singlecellpicker/com/valve-control)在電動顯微鏡上工作。真空罐和超壓罐通過兩個高速流體閥與垂直微量移液管相連。在Petri培養皿中掃描樣本并用計算機視覺或手動檢測細胞后,微移液管通過打開微移液管和真空罐之間的閥門逐個拾取所選細胞。然后,通過打開超壓罐和微量移液管之間的閥門,將單個細胞沉積到PCR管中(K?rnyei等人2013;Salánki等人2014a)。

在目前的工作中,Cellsorter優化并應用了基于微移液管的裝置,以最小化其拾取體積并最大限度地提高其精度。Cellsorter開發了一種全自動、緊湊的壓電微移液管,結合高分辨率成像和<1nl液體處理精度(CellSorter Kft(2019)壓電微移液管PCT專/利申請HU 2019/000002)(www/singlecellpicker/com/piezo-head)。它消除了塑料管、閥門、注射器和壓力罐的影響。它可以分離敏感或稀有細胞或效率>90%的細胞??捎糜趎l級液滴打印,包括單細胞打印

打開壓電吸管并將壓電頭固定在顯微鏡(蔡司)上后,校準壓電致動器,cellsorter測量了壓電致動器(PI Ceramic P-885.11)自由端的位移,作為電壓的函數,從0 V開始到+100 V,然后從+100 V回到0 V。相鄰測量點之間的電壓階躍以50ms線性斜坡施加。Cellsorter在每個施加電壓步驟后捕獲致動器的圖像,并將所有圖像與在0 V電壓下捕獲的第一張圖像進行比較,以計算位移。Cellsorter用線性曲線擬合完整數據:y=0.0727±0.0055[μm/V]x+0.9502μm;R2=0.9008。產生的7.3μm/100 V在供應商(PI Ceramic)規定的范圍內

校準壓電微移液管以量化壓電微移液管的液體處理精度,首先,Cellsorter在疏水35 mm皮氏培養皿(Greiner)中在2 ml礦物油中生成水滴。對于±50 V(100ms線性斜坡)的較大電壓,使用0.5μl Hamilton注射器沉積約0.1μl水滴。為了測試±5±10 V(100ms,線性斜坡)的較低電壓,使用內徑(內徑)為30μm的微移液管,使用1×1 mm2 NBR 70 O形環和+100 V制備約20 nl水滴。產生液滴后,微移液管靠近培養皿表面,距離液滴內部100μm。Cellsorter用10倍或20倍的物鏡測定水滴體積的變化。Cellsorter將顯微鏡聚焦在液滴底部,并測量液滴與培養皿之間界面的d1直徑,即液滴中缺失的球形帽的直徑。Cellsorter拍攝了液滴的圖像,并在其輪廓上畫了一個圓圈。Cellsorter還測量了球形液滴的D1直徑(圖1c)。然后Cellsorter施加正或負電壓階躍。測量至少重復三次。Cellsorter再次測量了液滴底部的d2直徑和球形液滴的d2直徑。Cellsorter根據d1、d1、d2和d2計算液滴體積,如下所示:

Vdroplet = Vsphere ? Vspherical cap, where (1)

Vspherical cap = hspherical cap ?π/6(3r2 + h2spherical cap), where(2)

h spherical cap = R1,2 ?√(R21,2?r21,2), where(3)

R 1,2 =D1,2/2, (4)

r1,2 =d1,2/2 (5)

 

Cellsorter用線性函數擬合測量數據。作為施加電壓階躍ΔU(V)函數的液滴ΔV(nl)體積變化如下:ΔV=0.21*ΔU? 0.1329; 斜率:0.21±0.08 nl/V,R2=0.9929。

使用內徑為30–70μm的微移液管,使用3.5×1.1 mm2 FPM O形環(超級密封),通過在礦物油或氟化油下在35 mm親水塑料培養皿(Greiner)中施加40–100 V(100 ms,線性斜坡)的電壓階躍,沉積油水珠下的納升液滴打印。這些液滴被認為是球形帽。為了計算親水表面上水滴的體積,Cellsorter測量了幾個代表性水滴的接觸角(θ):

sin θ= 2hr/(r2 + h2)    (6)

液滴高度(h)與表面上液滴直徑(2r)之比為0.49±0.05,因此θ=82°±5°。然后,Cellsorter只測量了液滴的(2r)直徑,并計算了它們的體積,如下所示:

V =πh (3r2 + h2) /6  (7)

where h = 0.98 ? r.

Cellsorter還根據壓電致動器的校準位移和O型環的尺寸計算了移液管的完整(理論)體積Vfull(nl),如下所示:

V  full = 0.0727 ? ΔU ? (RO-ring + rO-ring)2 ?π,(8)

式中,RO環為O型環內徑的一半,rO環為O型環高度的一半

測量壓電微移液管中的流體流量波動Cellsorter使用1×1 mm2 NBR 70 O形環測量了內徑為30μm的微移液管中的流體流量波動。壓電頭包括致動器和微量移液管,通過磁性支架水平固定在配備5×物鏡的顯微鏡上。在內徑為1.2mm的玻璃管中填充2μm熒光紅色顆粒(Spherotech)懸浮液,該懸浮液在0.1%Triton-X-100中稀釋至200倍。玻璃管的兩端用一滴礦物油封閉,以防止水懸浮液蒸發。微量移液管進入試管,直到它到達珠子懸浮液。Cellsorter每隔30秒記錄一次珠子的運動。Cellsorter在這些間隔內對壓電致動器施加正負電壓階躍,并在顯微鏡上觀察其效果。

粒子跟蹤測速儀(PTV)和流量計算Cellsorter使用PTV來計算由電壓階躍觸發或由無電壓階躍的波動驅動的玻璃微移液管中的流量。在每段視頻中,Cellsorter可以跟蹤約20顆珠子。Cellsorter使用免費的視頻到JPG轉換器將視頻中的幀提取到JPG文件中。Cellsorter使用了TrackMate ImageJ插件(www/imagej/net/Getting_started_with_Track Mate),以分析珠子的軌跡。為了檢測圖像中的珠子,Cellsorter使用了高斯差分法(DoG檢測器),這是一種可用于斑點檢測和跟蹤的特征增強算法。DoG是一種帶通濾波器,用于去除代表噪聲的高頻分量和代表圖像中較大均勻區域的一些低頻分量。在第一幀中正確檢測到珠子后,Cellsorter使用簡單線性分配問題(LAP)跟蹤器粒子鏈接算法。Cellsorter將珠子軌跡保存在xml文件中,以便使用MATLAB代碼對其進行分析,以計算下面描述的數量。柱面坐標系固定在微量移液管的軸上,從微量移液管尖/端測量軸向坐標X,徑向坐標R(圖2a)。珠子的徑向位移可以忽略不計。Cellsorter計算了軸向位移(圖2d):

圖1壓電微量移液管。帶有彈性管和注射器的標準微量移液管。壓電微移液管的示意圖。頂部的壓電致動器被推到尺寸在[1–6]×1 mm范圍內的O形圈上。玻璃微移液管通過垂直通道連接到O形圈的內部體積。這些都裝滿了水。相位對比度照明由與微移液管同心排列的一圈LED提供。c校準原理。當使用1×1 mm2 O形環向壓電元件施加電壓時,Cellsorter測量了先前沉積在油下疏水表面上的水滴體積的變化。根據電壓階躍前后的液滴直徑(D1,D2)和接觸面積直徑(D1,D2),Cellsorter計算了作為施加電壓函數的體積變化(補充圖3)。結果,Cellsorter獲得了斜率為0.21±0.08 nl/V(d)的校準曲線。e–g納升液滴打印。e使用內徑為70μm的移液管(3.5×1.1 mm2 O形圈)在礦物油下打印+75 V(100 ms,線性斜坡)的水滴。根據[0]中壓電致動器f的位移→ 100 V](矩形)和[100→ 在0 V(圓形)范圍內,Cellsorter計算了帶有3.5×1.1 mm2 O形環的移液管的完整體積變化。壓電位移的滯后在0→ + 100→ 0伏航向。打印液滴g的體積非常均勻(補充圖4)。由于水和油之間的表面張力,它低于計算的移液全體積,并且取決于微移液管的直徑(30、50、70μm)。當從微移液管中推出液滴時,由于表面張力,水和油界面處的拉普拉斯壓力與微移液管的直徑成反比。對于I.D.30、50和70μm微量移液管,Cellsorter能夠成功應用于打印液滴的最小電壓分別為80、50和40 V(Cellsorter沒有在80 V下使用I.D.50和70μm微量移液管)

 

Δx(t) = x(t) ? x(t ?Δt),(9)

平行于微量移液管軸線的珠子。Cellsorter計算了珠子的軸向速度:

v(t) =Δx(t)/Δt  (10)

圖2壓電微移液管中的流量波動。從側面看微移液管的幾何形狀。Cellsorter測量了內徑為30μm的微量移液管的錐角(α=6.3°)及其孔徑半徑(R0)。圓柱坐標系固定在微移液管的軸上,從微移液管尖/端測量軸向坐標X和徑向坐標R。微移液管的壁在b中用白色虛線表示。Cellsorter將微移液管放入另一個直徑為D=1.2 mm的玻璃管中。這個外管充滿了水,其中含有2μm的熒光珠,在圖像左側顯示為白點。外管內的水相兩端被一滴油堵塞,以避免蒸發。紅色虛線表示左側的水和右側的油之間的界面。當微移液管從右側向內推入外管并到達水相時,微珠進入微移液管。Cellsorter跟蹤并分析了移液管(c)中微珠的運動。d微移液管中六個選定微珠的位移隨時間的變化。在5分鐘時施加+6 V的電壓階躍。Cellsorter根據微珠位移和微移液管的幾何形狀計算流速e。從微量移液管流出的流體的計算體積如f所示(見補充視頻1,2)

由于微珠的密度較低,Cellsorter無法在移液管中*采樣拋物線速度分布。因此,Cellsorter使用以下公式計算基于最快胎圈的估計流量(圖2e):

Q(t) = v(t) ? A(x) (11)

式中,A(x)是特定珠粒位置處微量移液管的橫截面(圖2a):

A(x) = R pipette(x)2 ?π, (12)

R pipette = (x + x0) tgα/2, (13)

x0 =R0/tgα/2  (14)

最后,Cellsorter計算流量V作為流量Q的時間積分(圖2f):

ΔV(Δt) =0Δt Q(t)dt. (15)

3T3細胞培養小鼠胚胎成纖維細胞(ATCC;CCL-92)在補充有10%FCS(Sigma)的MEM中按照ATCC細胞生物學收集指南生長。用親脂性熒光染料DiI(10μM,37℃下30分鐘,體外培養)對細胞亞群進行染色。在分選之前,3T3細胞在37℃下用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液(Gibco,25300)處理6分鐘;然后,將細胞懸浮液以300 g離心2分鐘(Ungai Salánki等人,2016)。

Jurkat細胞培養根據ATCC細胞生物學收集指南,永生化人類T淋巴細胞系(ATCC;TIB-152)在補充有10%FCS(Sigma)的RPMI-1640培養基中生長。用親脂性熒光染料DiI(100μM,37℃下15分鐘,體外培養)對細胞亞群進行染色;然后,以1500 RPM的轉速離心5分鐘。

HT-29細胞培養根據ATCC細胞生物學收集指南,將HT-29大腸腺癌細胞系(ATCC;HTB-38)培養在補充有10%FCS的McCoy 5A培養基中。在分選之前,用1×胰/蛋/白酶-EDTA溶液(Gibco,25300)在37℃下處理HT-29細胞5分鐘;然后,以900 RPM的轉速離心細胞懸浮液5分鐘。

3D打印微孔到皮氏培養皿Cellsorter將高度為1 mm的微型多孔板打印到塑料皮氏培養皿(Greiner)中。Cellsorter使用定制改進的商用3D打印機(Ultimaker)在35 mm皮氏培養皿中打印四個5×5 mm2正方形的4孔板(Ungai Salánki等人,2016)。

PDMS微孔Cellsorter用聚二甲基硅氧烷(PDMS,Dow Corning Sylgard 184)制備了四個5×5 mm2微孔,用于模制4孔嵌件。PDMS彈性體和固化劑以10:1的比例混合,并模塑成由聚甲醛(POM)制成的模塑形式。PDMS在室溫下聚合過夜,并從模塑形式上剝離。Cellsorter將高度為1 mm的PDMS插入物放入疏水培養皿(Greiner)中。

在微孔中創建一薄層細胞懸浮液,Cellsorter用20μl細胞培養基覆蓋所有四個微孔,以濕潤疏水性35 mm皮氏培養皿的表面。Cellsorter從孔中取出多余的培養基,用于從中提取細胞。Cellsorter在皮氏培養皿中加入2毫升礦物油(sigma)。將添加10%FCS的10-15μl培養基中的1500-50000個細胞注射到皮氏培養皿中的一個5×5 mm2微孔中。

從細胞懸浮液中自動分離單細胞Cellsorter使用自動微量移液管裝置(細胞分選機)(K?rnyei等人2013;Salánki等人2014a)在顯微鏡上檢測和分離單細胞。壓電致動器(PI陶瓷)控制微移液管的體積。內徑為30μm的微移液管被Sigmacote(Sigma-Aldrich)包覆,以避免細胞粘附在微移液管壁上。Cellsorter將微量移液管插入壓電頭,并用去離子水填充。Cellsorter用微量移液管的尖/端接觸培養皿的表面,以精確校準其垂直位置(K?rnyei等人,2013)。Cellsorter通過捕獲覆蓋整個或部分5×5 mm2的馬賽克圖像來掃描感興趣區域。使用CellSorter軟件中實現的局部方差圖像分割方法,通過計算機視覺檢測熒光細胞。為了優化細胞選擇,可以手動調整檢測參數(包括靈敏度、細胞亮度范圍和細胞大?。?。選擇要分離的細胞格后,Cellsorter運行排序過程。在提取第一個細胞之前,將培養基放入微量移液管中,以避免細胞的滲透休克。為了實現精確的細胞定位,Cellsorter使用自適應細胞定位校正了細胞坐標(Ungai Salánki等人,2016)。為了拾取和沉積單個細胞,Cellsorter施加了分別為6伏(100毫秒,線性斜坡)和+30伏(2000毫秒,線性斜坡)。在將細胞沉積在比Cellsorter用于拾取的體積更大的體積中之后,Cellsorter需要將移液管重置到其初始位置(電壓)。因此,Cellsorter在無細胞培養基儲存庫中,通過應用? 24伏(2000毫秒,線性斜坡)。當拾取細胞時,尖/端位于皮氏培養皿表面上方30μm處,當將細胞沉積在貯存器中時,尖/端位于皮氏培養皿表面上方50μm處。沉積區域選擇在4孔微孔板的第二個孔中。Cellsorter把第三口井用作水庫。單細胞分離的所有步驟均由軟件(CellSorter)*自動控制完成。

細胞活力測定Cellsorter使用HT-29細胞量化了單細胞分離程序對細胞活力的影響。細胞在新的組織培養皮氏培養皿中沉積并進一步培養。分離的細胞在37°C的5%CO2中培養2小時,然后過夜。2小時后,首先通過計數具有正常粘附形態的細胞來檢查存活率。隔夜培養后,更換培養基,并在顯微鏡上計數*鋪展的細胞。如果一個細胞在皮氏培養皿中的培養時間內分裂,它仍然只被算作一個細胞。

Cellsorter開發了一種緊湊的壓電微移液管(圖1,補充圖1,2),可以輕松地自動化并集成到各種(生物)化學工作流程中。它消除了塑料管、閥門、注射器和壓力罐的影響(K?rnyei等人,2013年;Salánki等人,2014a;Ungai Salánki等人,2016年)。 其操作類似于滴管或手持移液管。對于樣品的高質量相襯度(Ph1和Ph2)照明,例如細胞或微小液滴,Cellsorter構建了與微移液管同心排列的LED環。因此,Cellsorter的方法可以*自動化使用熒光或相襯照明活細胞。微移液管(鋒利的玻璃毛細管)連接到壓電致動器。移液管的體積范圍由壓電致動器和玻璃微移液管之間的O形圈設置。Cellsorter采用了各種NBR 70 O型環,包括1×1、3×1、4×1和6×1(內徑×高度)mm2尺寸,在1-50 V工作電壓范圍內,其近似范圍為[0.2-10]、[0.8-40]、[1.2-60]和[2.5-125]nl。壓電致動器(圖1b)的膨脹推動并變形O形圈,從而減小其內部體積(補充圖2)。它導致流體在微移液管中流動,最后從微移液管流出到皮氏培養皿。當壓電致動器收縮時,微量移液管從皮氏培養皿中吸出液體。液體處理精度由壓電致動器和移液管中的熱波動決定。

Cellsorter使用一種簡單的方法校準壓電吸管,方法是在顯微鏡上將水注入油環境中的水珠中(圖1c,d,補充圖3)。Cellsorter通??梢栽谝韵虑闆r下達到亞納升精度:移液體積在0.5-10 nl范圍內(表1)。

Cellsorter使用3.5×1.1 mm2的O形圈將壓電吸管用于nl液滴打印。Cellsorter在油下將水滴打印成網格圖案(圖1e,補充圖4)。液滴的橫向坐標由軟件設定,整個打印過程無需人工干預。打印nl液滴形成的任何2D圖案都可以以類似的方式進行。Cellsorter測量了打印液滴的體積(圖1e,g),并將其與根據壓電致動器的位移(圖1f)計算的移液管的完整體積變化進行比較。壓電位移在0→ + 100→ 0伏航向。Cellsorter可以通過壓電電壓在10–60 nl范圍內控制打印液滴的體積。打印液滴均勻,標準偏差為幾nls(圖1g)。液滴的體積低于計算得出的吸液全體積,這取決于微吸液管的直徑,因為水和油之間的表面張力。(將水推回移液管的拉普拉斯壓力與移液管直徑成反比。)

Cellsorter使用一個1×1 mm2的O形環,用熒光微球的粒子跟蹤測速法定量了微量移液管中流體流動的微觀波動。熒光微球放在玻璃管內,末端帶有礦物油塞,以避免蒸發(圖2a,b)。Cellsorter放下微量移液管,在顯微鏡上觀察微珠的運動。Cellsorter記錄了珠子的運動(補充視頻1、2),并使用ImageJ TrackMate軟件插件進行分析(www/imagej/net/Getting_start ed_with_Track Mate(圖2c)。Cellsorter在每個實驗中跟蹤觀察了約20個珠子,并計算了珠子的位移作為時間的函數(圖2d)。根據胎圈位移確定流速和流量(圖2e、f、補充圖5)。峰值的估計流速為373±29 pl/s,平均體積波動率為36±6 pl/s,因此信噪比為10。

Cellsorter使用1×1 mm2 O形環將壓電吸管用于單細胞從懸浮液中分離。細胞被保存在一層薄薄的培養基上,上面覆蓋著油,以盡量減少液體的流動和培養基的蒸發。Cellsorter采用適應性細胞靶向(Ungai Salánki et al.2016)來利用內徑為30μm的微移液管實現適當的細胞靶向(圖3a-D)。Cellsorter使用了三個獨立的孔:一個用于拾取,第二個用于沉積細胞,第三個用于重置壓電移液管。Cellsorter施加的電壓為? 6V(100ms,線性斜坡)以拾取體積為1.25±0.48nl的單個細胞。Cellsorter可以將單細胞分離的效率從以前的約75%(Ungai Salánki et al.2016)提高到90%以上,而無需移除任何相鄰細胞。3T3、Jurkat和HT-29細胞的單細胞拾取效率分別為95±1.2%(n=82)、96±5.8%(n=48)和91±0.8%(n=33)(圖3f-h)。Cellsorter以6 nl的較大體積沉積細胞,以達到100%的沉積率(圖3e)。細胞分選的空間分辨率為29±3.6μm,也就是說,距離目標細胞較遠的細胞未被移除(圖3i,j)。

 

Cellsorter量化了分離的單個細胞在分離后2小時和1天的存活率。分離2小時后,93±3%的研究(n=30)細胞存活。隔夜培養后,83±9%的分離細胞存活。

表1壓電微移液管的校準

Voltage (V)

?5

+5

?10

+10

?50

+50

Volume (nl)

(mean ± SD)

?0.64±0.38

+0.78±0.35

?1.44±0.56

+1.24± 0.51

?11.05±1.53

+10.31±0.95

Cellsorter通過在顯微鏡上將水注入(或從)先前沉積在礦物油下的水滴(或從中拉出)作為施加電壓的函數來校準壓電微移液管。當正電壓步驟導致注射時,負電壓步驟將水拉入微量移液管(圖1c,d)。Cellsorter通過測量施加電壓前后液滴的直徑和接觸面積的直徑來計算液滴體積的變化(補充圖3)。Cellsorter使用了一個1×1mm2的O形圈

 

圖3單細胞分離。單細胞分離前(a)和后(b)的小鼠成纖維細胞。c、 d放大a、b中虛線框定的區域。I.d.30μm微移液管的尖/端顯示在a的角/落。/選擇分離的標記單元格中的黃色框。紅框中彼此太近的細胞被軟件排除在外,以避免拾取多個細胞。相同位置的框架如b所示。圖像比較表明,即使由于培養皿中的流體對流,細胞從初始位置移位,目標細胞也可以很容易地分離出來,而不必拾取紅色框架中的細胞。整個隔離過程可以被跟蹤并保存在實時取景攝像機圖像中,用于回顧和記錄實驗。在e中,選擇24個單個Jurkat細胞分離成網格模式,細胞之間的距離為500μm。由于拾取#12和#23單元格失敗,網格的相應位置為空。在Cellsorter測試的所有細胞類型中,單細胞分離f–h的效率都在90%以上。i在微孔中混合50個熒光細胞和50000個未標記細胞的細胞培養區域的紅色熒光和相位對比度圖像的組合圖片。用顯微移液管(如圖角所示)采集熒光細胞。四個相鄰的細胞也被移除,如拾取后拍攝的圖像j所示。通過測量靶細胞中心與最遠移除細胞中心之間的距離,Cellsorter計算了分選的空間分辨率(R):R=29±4μm

Cellsorter開發并校準了用于納升范圍內液體處理的壓電微移液管。移液管的工作原理和幾何形狀非常簡單。它包含一個由壓電致動器變形的彈性O形圈(CellSorter Kft(2019)壓電微移液管PCT專/利申請HU 2019/000002)。移液管的體積范圍由O形環的直徑設置;因此,通過更換O型環,相同的裝置可以應用于不同的體積范圍。對微移液管的校準證明,通過應用~[5–50]V,該裝置可以在[1–10]nl范圍內可靠地使用。Cellsorter使用粒子跟蹤測速儀測量了微移液管的皮克級波動。平均體積波動率為36±6 pl/s,導致信噪比為10。

Cellsorter將該裝置應用于油下納米級水珠打印。Cellsorter可以通過壓電電壓在[10–60]nl范圍內控制打印液滴的體積。打印液滴均勻,標準偏差為幾nls。Cellsorter還將該裝置用于單細胞分離。它將基于成像的單細胞分離效率從以前的75%提高到90%以上。這一改進在分離稀有或珍貴細胞時至關重要,尤其是在醫療應用中。為了獲得高質量的相位對比成像,Cellsorter構建了與微移液管同心排列的LED環。微移液管可以在顯微鏡上使用熒光或透明照明進行全自動操作。Cellsorter設想這項新技術不久將成為醫學診斷中單細胞操作的標準工具,例如循環腫瘤細胞分離。

 

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